Ana numuneyi kullanım başına tüplere bölmek, her analizin numunesini tek çözülmeyle sınırlar. Örnekte 1 mL plazma dört analiz için ayrıldığında tek tüpte dördüncü analizin numunesi dördüncü çözülmededir; 250 µL'lik dört alikotta her analiz kendi tüpünü bir kez çözer.
| Analiz | Tek tüp (1 mL) | Dört alikot (4 × 250 µL) |
|---|---|---|
| 1. analiz | 1. çözülme | 1. çözülme |
| 2. analiz | 2. çözülme | 1. çözülme |
| 3. analiz | 3. çözülme | 1. çözülme |
| 4. analiz | 4. çözülme | 1. çözülme |
Çözülme sayısı için evrensel sınır yok. NCI En İyi Uygulamalar Ekleri'nin (2026, 4. baskı) 7.12 bölümü literatürün çeliştiğini yazar. EDTA plazmada miR-16 bir çalışmada sekiz çözülmeye kadar sabit kalmış, başka bir çalışmada üç ve üzerinde düşmüştür. Serumda iki ya da dört çözülme olayında miR-16 değişmemiştir. Kılavuz bu yüzden çoklu çözülmeden kaçınmayı ister ve etkinin analite ve numune türüne bağlı olduğunu belirtir.
Dolaşımdaki protein: 3-5 çözülme. Protein ölçümlerinde de tablo tek değildir. 30 plazma ve serum örneği üzerinde yapılan bir çalışmada 3, 4 ve 5 çözülme, 2 çözülmeyle karşılaştırıldı (Korea CDC ve Pusan Ulusal Üniversitesi, 2015). Interferon-γ, IL-8 ve VEGF-R2 beş çözülmeye kadar değişmedi; MMP-7, TNF-α ve VEGF ise değişti. MMP-7 ve VEGF artış eğilimindeydi: plazmada en fazla yaklaşık %15, serumda yaklaşık %7.
Örnek hesap (başlangıç değeri varsayımsal 100 birim): plazmadaki en fazla %15 artış 115 birime, serumdaki en fazla %7 artış 107 birime karşılık gelir. Bu rakamlar üst sınır olarak okunmalı; her analitte ve her laboratuvarda aynı olmaz.
Çözme ve karıştırma
Donmuş alikot buz üzerinde, ara sıra nazikçe karıştırılarak ve gereken en kısa sürede çözülür (NCI 6.6.2). Çözülen plazma ya da serum iyice karıştırılıp 1.000-1.600 x g'de 1-2 dakika santrifüj edilir; bu, miRNA ekstraksiyonundan hemen önce kriyoglobulinleri çöktürür (NCI 6.6.3).
Hacim ve saklama. NCI, plazma ya da serumun tek bir ticari kitle ekstraksiyon için genelde 100-1.000 µL alikota bölünmesini yeterli bulur; doğru hacim ekstraksiyon yöntemine, teste ve beklenen miRNA miktarına bağlıdır. Alikotlar ≤ -80 °C'de saklanır (NCI 6.5.5).
Bölme önceki maruziyeti silmez: ana numune daha önce çözülmüşse her alikot bu geçmişi taşır. Her tüpe kaynak numune kodu, hazırlama saati, hacim ve saklama yeri yazılır; her çözülme ayrıca işlenir. NCI, hazırlama koşullarını tüp bazında kodlayan ISBER SPREC sistemini örnek gösterir.
Bölmenin de bedeli vardır: her tüp yeni bir kap yüzeyi, etiket ve bulaşma riski demektir. Bu yüzden alikot sayısı planlanan kullanım sayısını aşmaz.